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注1:整个缀合过程可以在 一天内完成。但是，缀合前对APC 的纯化可能需要24-48小时。除了下面列出的材料外，您还需要浓度至少为 2 mg/ml 的抗体溶液。请您在进行APC抗体缀合实验之前熟悉如何使用脱盐柱以及如何获取吸光度光谱。

 

注 2 : SMCC-APC  缀合物非常稳定(在“交换缓冲液”中，在4C下至少可以稳定几个月)。因此，  如果您需要节省一部分时间，可以选择同时缀合10 毫克或更多的 APC,并将其用于几次抗体实验(在几周内)。SMCC-APC 的长期储存作为饱和硫酸铵沉淀物。

 

一  APC的制备

1.将 APC 纯化。缀合前的浓度通常为 5-10  mg/ml 。 注意：APC 在缀合前作为SAS (硫酸铵钠)

沉淀物稳定。如果将APC以SAS 沉淀物的形式储存，则必须在使用前进行大量纯化。在用每毫升1 升的“透析缓冲液”透析之前，用每毫升1 升APC 的PBS进行透析2 次。

 

2.使用1 .7毫克APC 修饰每毫克lgG,包括在缓冲液交换过程中损失的额外10%。

 

3.检查 APC 的纯度和浓度，请测量280、620和655 nm  处的吸光度。 (1 mg/ml的APC 在 655nm处的OD 为 5 . 9 ) 。 655/620 比 率 > 1 . 4表明杂质被充分去除；655/280 比 率 > 4 表明所有其他蛋白质均已充分去除

 

二  .A PC的活化

1.使用前在无水 DMSO 中制备10 mg/ml的SMCC储备溶液。

 

2.每毫克 APC 加 入 6μlSMCC,并进行涡旋。将反应管用铝箔包好，室温下旋转60 分钟。

 

3.将纯化的 APC 过凝胶过滤柱来交换缓冲液。

 

注意：对于失败或效果较差的结合，增加或减少SMCC相对于APC 的量，可能会有所好转。

 

三 . 1gG还原

1.在蒸馏水中制备1MDTT(15.4 mg/100 μl) 的新鲜溶液。

 

2.1gG 溶液浓度应为4 mg/ml 或更高，这样效果比较好。还原几乎可以在任何缓冲液中进行； MES 、磷酸盐和TRIS 缓冲液 (pH 范围为 6 至8)已被验证可以使用。如果抗体浓度低于2  mg/ml,则应浓缩。缓冲液交换柱上的损失应额外增加10%。

 

3.用 DTT 配制20 mMlgG 溶液：每毫升 IgG 溶液加入 20μ lDTT 原液并搅拌。室温下静置30分钟，无需额外搅拌 (以尽量减少半胱氨酸再氧化为胱氨酸)。

 

4.将还原的lgG 通过预平衡的“交换缓冲液”过滤柱。收集0.25毫升的级分，测定蛋白浓度，并将含有大部分lgG 的级分汇集在一起。可以通过分光光度法或比色法完成。

 

5.此步骤后尽快进行缀合。

注意：对于结合较差或失败的情况，降低 DTT浓度可能会有所帮助。

 

四 .进行缀合

1.每毫克IgG添加 1 . 5毫克 SMCC-APC 。 用铝箔包裹反应管并在室温下旋转60 分钟。注意：这些摩尔比 ( 每 1gG 约 2 个 APC)效果很好。对于失败或效果不佳的结合，不同的摩尔比可能会有所帮助。

 

2.60分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。

 

3.在 1.0 ml干DMSO 中制备10 mg NEM的新鲜溶液。

 

4.每 毫 克 |gG 添加 34μ g(3.4μl) 。 室温下包裹并旋转20 分钟。

 

2.60分钟后，必须去掉 lgG 上未反应的游离巯基。

 

3.在 1.0 ml干 DMSO 中制备 10 mg NEM的新鲜溶液。

 

4.每毫克 |gG添加 34μ g(3.4μl) 。 室温下包裹并旋转20 分钟。