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Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒(比色法)
简要概述
Amplite NADP/NADPH比率检测试剂盒 （比色法）是美国AAT Bioquest研发的检测NADP/NADPH的试剂盒，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和NADP是细胞中发现的两种重要的辅酶。 NADH（NADPH）是NAD（NADP）的还原形式，NAD（NADP）是NADH（NADPH）的氧化形式。 NAD或NADP在氧化还原反应中起辅助因子的作用，在细胞反应中转移电子。 氧化形式和还原形式之间的平衡是NAD / NADH（NADP / NADPH）比率。 该比率是指示细胞氧化还原状态的重要组分，并且它是反映代谢活性和细胞健康的测量。 在健康的哺乳动物组织中，游离NAD和NADH之间的比率的估计可以高达700。相反，NADP / NADPH比率通常为约0.005，因此NADPH是该辅酶的主要形式。
该Amplite 比色NADP / NADPH比率分析试剂盒提供了一种比色法，用于测量培养细胞中细胞内总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。 在该测定中，裂解物中的NADPH可以用NADPH提取溶液提取，然后通过NADPH探针识别，在反应后得到黄色染料，其在460nm处具有吸光度。 产生的染料量与细胞裂解物中NADP或NADPH的浓度成正比，可用作细胞NADP / NADPH浓度的指示剂。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的NADP/NADPH检测试剂盒。
产品说明书
96孔板检测示例
概述
准备25μLNADPH标准品和/或测试样品
加入25μLNADPH提取液
在室温下孵育15分钟
加入25μL中和溶液
加入75μLNADPP/ NADPH反应混合物在室温下孵育15分钟至2小时监测 在460nm处的吸光度
注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。
操作步骤
1.准备NADPH原液：
将200μLPBS缓冲液加入到NADPH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADPH储备溶液。
注意：未使用的NADPH原液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。
2.制备NADP / NADPH反应混合物：
2.1将8mL NADPH探针缓冲液（组分B-II）加入到NADP / NADPH回收酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。
2.2将2 mL NADPH探针（组分B-I）加入上述瓶中（来自步骤2.1）并充分混合。
注意：这种NADP / NADPH反应混合物足以进行125~200次分析。 未使用的NADP / NADPH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。
3.准备连续稀释的NADPH标准品（0至2μM）：
3.1将2L 1mM NADPH储备溶液（来自步骤1）加入998L PBS缓冲液（pH7.4）中，产生2M（2 pmols / L）NADPH标准溶液。
注意：稀释的NADPH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。
3.2取200μL2MNADPH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：2连续稀释，得到1，0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0313和0M系列稀释的NADPH标准品。
4.运行总NADP / NADPH分析（总共400个分析/试剂盒）：
4.1如说明书中的表1和2中所述，将NADPH标准品和含有NADP / NADPH的测试样品的系列稀释液加入白色/透明底96孔微孔板中。
注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞。 （详见附录）。
4.2将50μL的NADP / NADPH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤4.1）的每个孔中，以使总NADP / NADPH测定体积为100μL/孔。
4.3在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
4.4使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
5.运行NADP / NADPH比率分析（总共250个分析/试剂盒）：
5.1如说明书中的表3和4中所述，将连续稀释的NADPH标准品和/或含NADP / NADPH的测试样品加入白色/透明96孔微量培养板中。
注意：根据需要准备细胞或组织样本。 为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞。
5.2对于NADPH提取（NADPH量）：将25μLNADPH提取溶液（组分D）加入含有NADP / NADPH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μL中和溶液（组分E）以中和NADPH提取物，如说明书中的表3和4中所述。
对于总NADP和NADPH（总量）：将25μLNADPP/ NADPH对照溶液（组分F）加入NADPH标准品的孔和含有NADP / NADPH的测试样品中。在室温下孵育10至15分钟，然后如说明书中的表3和4中所述添加25μL提取对照溶液（组分F）。
注意：根据需要准备细胞或组织样本。为方便起见，裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。
5.3将75μL的NADP / NADPH反应混合物（来自步骤2.2）加入NADPH标准品，空白对照和测试样品（NADP / NADPH）的每个孔中，并测试样品（NADPH提取物）（来自步骤5.1）以使总量达到测定体积为150μL/孔。
5.4在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。
5.5使用吸光度读板仪在460 nm处检测吸光度的增加。
数据分析
空白孔中的吸光度（仅PBS缓冲液）用作对照，并从具有NADPH反应的那些孔的值中减去。
图1. Amplite™比色NADP / NADPH比率分析试剂盒用于使用SpectraMax酶标仪（Molecular devices）测量白色/透明96孔微量培养板中的总NADP / NADPH量和NADP / NADPH比率。
A-总NADPH和NADP剂量反应：孵育1小时可检测到低至0.03μM的总NADPH。
B-NADP / NADPH比例：用或不用NADP提取溶液处理等量的NADP和NADPH混合物15分钟，然后在室温下用提取溶液中和。 在460nm读取信号。 NADP / NADPH摩尔比基于图1B中所示的吸光度计算。
附录：使用组分G（NAD / NADH裂解缓冲液）的测试样品制剂
1.植物细胞样品：
用裂解缓冲液以200mg / mL均化，并以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测试。
2.细菌样品：
离心收集细菌细胞（（10,000 g，0°C，15 min）。使用约1亿至1千万细胞/ mL裂解缓冲液，将处理后的溶液在室温下保持15分钟。以2500 rpm离心5分钟， 用上清液进行试验。
3.哺乳动物细胞样本：
从平板孔中取出培养基，每1-5百万个细胞使用约100μL裂解缓冲液（或在96孔细胞培养板中使用50-100μL/孔），并将处理过的溶液在室温下保持15分钟。 直接使用细胞裂解液或以1500 rpm离心5分钟，使用上清液进行测试。
4.组织样品：
称取约20mg组织，用冷PBS洗涤。 在微量离心管中用400μl裂解缓冲液均化。 以2500rpm离心5-10分钟，使用上清液进行测定。
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18502920169
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029-68064558
AAT Bioquest NADP/NADPH比率检测试剂盒(比色法) 货号15274
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