Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒荧光能量共振转移法

产品订购：QQ:1485814040

简要概述

Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒提供了一种便捷的分析方法，用于检测G蛋白偶联受体系统中腺苷酸环化酶的活化。与其他商用ELISA cAMP分析试剂盒相比，这种均质的cAMP分析试剂盒不需要洗涤步骤或乙酰化步骤。该测定基于荧光cAMP示踪剂和未标记的游离cAMP之间固定数目的抗cAMP抗体结合位点的竞争。游离cAMP从HRP-cAMP /抗cAMP抗体复合物中取代了荧光cAMP示踪剂。抗cAMP抗体用我们的TR Fluor Eu标记，而cAMP示踪剂包含我们的trFluor 650。在没有cAMP的情况下，trFluor 650-cAMP缀合物仅与TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合。但是，测试样品中未标记的游离cAMP竞争TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体偶联物，因此抑制了trFluor 650-cAMP与抗cAMP抗体的结合。 trFluor 650标记的cAMP示踪剂仅具有纳秒级的荧光寿命，而TR Fluor Eu标记的抗cAMP抗体结合的荧光cAMP示踪剂由于TR-FRET而具有更长的荧光寿命值。 FRET的大小与样品中cAMP的浓度成正比。该测定可以使用96孔或384孔微孔板进行。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供优质的Screen Quest 免洗cAMP检测试剂盒。

产品说明书

样品实验方案

溶液配制

储备溶液配制

cAMP标准（1mM）：将100 µL稀释剂（组分E）添加到cAMP标准品（组分C）中，并充分混合。注意：未使用的cAMP标准液可以等分并保存在-20℃下。

工作溶液配制

1. Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液：将55 µL（#36379）或550 µL（#36380或＃36381）稀释剂（组分E）添加到Anti cAMP-trFluor Eu（组分A）小瓶中。将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液（组分D）中。

2. cAMP-trFluor 650工作溶液：在cAMP-trFluor 650小瓶（组分B）中加入55 µL（#36379）或550 µL（#36380或＃36381）稀释剂（组分E）。将50 µL重构溶液添加到2.5 mL细胞裂解缓冲液（组分D）中。

实验步骤

1.细胞制备：

1.1对于贴壁细胞：将细胞在生长培养基中以30,000-100,000个细胞/孔在96孔板中过夜培养。

1.2对于非贴壁细胞：从培养基中离心细胞，然后将细胞沉淀以100,000-300,000个细胞/孔的速率悬浮在培养基中，在96孔板中培养。实验前，将板以800 rpm的速度离心2分钟。

1.3根据需要处理细胞：以下是用Forskolin处理的Hela细胞在96孔板中诱导cAMP的示例。在生长培养基中添加25 µL细胞，在Hanks中加入25 µL /孔的100 µM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液（HHBS），在5％CO₂、37℃恒温箱中孵育15分钟。注意：应单独评估每个细胞系，以确定细胞密度。细胞可以在实验的前一天或实验当天接种，具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。

表1.黑色96孔板中cAMP标准品和测试样品的布局。 CS = cAMP标准（CS1-CS7）; BL =空白对照； TS =测试样品。

BL	BL	TS	TS
CS1	CS1	...	...
CS2	CS2	...	...
CS3	CS3
CS4	CS4
CS5	CS5
CS6	CS6
CS7	CS7

表2.每个孔的试剂组成。

孔	容积	试剂
CS1-CS7	25 µL	连续稀释
BL	25 µL	稀释剂（组分E）
TS	25 µL	测试样品

2.细胞裂解物中的cAMP测定

2.1根据表1和表2提供的布局，准备并添加cAMP标准品（CS），空白对照（BL）和测试样品（TS）。对于384孔板，使用12.5 µL的每种相应试剂代替25 µL 。注意：测试样品可以是非刺激或刺激的样品。

2.2在cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中加入25 µL处理液（化合物重悬于缓冲液中），以使总cAMP测定体积为50 µL /孔。对于384孔板，将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中，总体积为25 µL /孔。

2.3将反应在室温下孵育30分钟。

2.4将25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液添加到cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总cAMP测定体积为75 µL /孔。对于384孔板，将12.5 µL工作溶液添加到每个孔中，总体积为37.5 µL /孔。注意：对于阴性对照，可以添加裂解缓冲液。

2.5将25 µL cAMP-trFluor Eu工作溶液添加到cAMP标准品，空白对照和测试样品的每个孔中，使总cAMP测定体积为100 µL /孔。对于384孔板，在每个孔中加入12.5 µL工作溶液，总体积为50 µL。

2.6将反应在室温下孵育30分钟。

2.7在兼容的TR-FRET（时间分辨荧光分析仪）上检测。

表3.方案总结

cAMP标准			细胞
负控制	正控制	标准曲线	负控制	非刺激	刺激
25 µL稀释剂	25 µL稀释剂	25 µL标准液	25 µL细胞	25 µL细胞	25 µL细胞
25 µL复合缓冲液	25 µL复合缓冲液	25 µL复合缓冲液	25 µL复合缓冲液	25 µL复合缓冲液	25 µL化合物
在室温孵育30分钟
25 µL裂解缓冲液	25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液	25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液	25 µL裂解缓冲液	25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液	25 µL cAMP-trFluor 650工作溶液
25 µL Anti cAMP-trFluor Eu工作溶液
在室温孵育30分钟

表4.兼容的仪器汇总

制造商	仪器
Berthhold Technologies	Tristar² S; Mithras LB 940; Mithras² LB 943
Hidex	Sense; Sense Beta Plus
Molecular Devices	Spectra Max i3X; Spectramax Paradigm; Spectramax M5e; Spectramax 3
Thermo Scientific	Varioskan Lux
Biotek	Synergy Neo2; Cytation 5; Cytation 3; Synergy H1; Synergy 2
BMG Labtech	PHERAstar; CLARIOstar; POLARstar Omega; Fluostar Omega
Tecan	Spark 10M; Infinite M100 Pro; Infinite F500; Infinite F200 Pro